1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测蜂蜜、动物组织（鸡肉、猪肉、鱼、虾）、牛奶、奶粉和鸡蛋等样本中的氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones，FQNs），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的氟喹诺酮类药物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗氟喹诺酮类药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含氟喹诺酮类药物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氟喹诺酮类药物的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，45min～15min

2.3 检测下限：

组织（鸡肉、猪肉、鱼、虾）…………0.3ppb

蜂蜜 ……………………………………0.4ppb

牛奶 ……………………………………3ppb

奶粉 ……………………………………6ppb

鸡蛋 ……………………………………3ppb

2.4 交叉反应率：

恩诺沙星…………………………………100%

诺氟沙星…………………………………174%

环丙沙星…………………………………170%

洛美沙星…………………………………132%

氟甲喹……………………………………126%

培氟沙星…………………………………125%  

达氟沙星…………………………………110%

沙拉沙星………………………………107%

双氟沙星………………………………84%

依诺沙星………………………………66%

氧氟沙星（消旋体）…………………58%

噁喹酸…………………………………28%

左氧氟沙星……………………………10%

麻保沙星………………………………4%

 2.5 样本回收率：

组织、蜂蜜、牛奶、奶粉、鸡蛋……85%±15%

3 试剂盒组成

酶标板……………………………96孔

标准液：各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3 ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高标准液（红盖）：100ppb……………1ml

酶标记物（红盖）…………………5.5ml

抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

20X浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

5X复溶液（黄盖）…………………50ml

说明书………………………………1份

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：无水乙腈、正己烷、浓HCl

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：0.15M盐酸溶液

    取5ml浓盐酸，加入去离子水中定容到400ml。

配液2：样本提取液

    量取10ml 0.15M盐酸溶液（配液1）加入到90ml无水乙腈中混合均匀。

配液3：复溶液

    将5×复溶液用去离子水5倍稀释，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 动物组织（鸡肉、猪肉、鱼、虾）处理方法

1）称2.0±0.05g 均质过的组织样本于50ml离心管中；

2）加入8ml样本提取液（配液2），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

3）取2ml清澈上层有机相至洁净干燥的10ml玻璃试管中，50-60℃水浴氮气吹干；

4）加入1ml正己烷，振荡2分钟，再加1ml复溶液（配液3），振荡30秒，室温4000转/分离心5分钟；

5）去除上层正己烷，取下层水相50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：2    检测下限：0.3ppb

5.3.2 蜂蜜处理方法

1）取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中，加6ml样本提取液（配液2），振荡5分钟，使其充分溶解；

2）加入3ml复溶液（配液3），加入11ml二氯甲烷，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；

3）吸去上层，取下层有机相8ml至干燥溶器中，50-60℃水浴氮气吹干；

4）用1ml复溶工作液溶解干燥的残留物，再加入正己烷1ml混合30秒，室温3000转/分以上，离心5分钟；

5）去除上层取下层50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：2    检测下限：0.4ppb

5.3.3 牛奶处理方法：

1）取25µl样本液与475µl复溶液（配液3）混合，振荡1分钟，使其充分溶解；

2）取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：20    检测下限：3ppb

5.3.4 奶粉处理方法：

1）称取0.5±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml去离子水，振荡，使其充分溶解；

2）取100µl样本液与400µl复溶液（配液3）混合，振荡1分钟；

3）取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：50    检测下限：6ppb

5.3.5 鸡蛋处理方法：

1）称取1.0±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml去离子水，振荡，使其充分溶解；

2）取100µl样本液与400µl复溶液（配液3）混合，振荡1分钟；

3）取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：30    检测下限：3ppb

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

实验开始前，用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应45分钟。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 显    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。

6.5 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

8 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

原创作者：上海臻科生物科技有限公司